你知道PCR技術(shù)的基本原理、各步驟的目的是什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、PCR技術(shù)基本原理

PCR是一種選擇性體外快速擴(kuò)增DNA片段的方法。在體外以類似于細(xì)胞內(nèi)DNA的半保留復(fù)制過程，以擬擴(kuò)增的模板DNA分子，與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及適合的緩沖體系組成的反應(yīng)體系，經(jīng)過重復(fù)地變性一退火一延伸三步，擴(kuò)增新的目的DNA鏈，這個(gè)過程通過控制反應(yīng)體系的溫度來實(shí)現(xiàn)。

PCR包含下列三步反應(yīng)：

1、變性(denaturation)

將反應(yīng)體系混合物經(jīng)加熱至94℃左右，維持較短的時(shí)間，使雙鏈DNA變成單鏈DNA，便于下一步引物的結(jié)合。

2、退火(annealing)

將反應(yīng)體系溫度下降到特定溫度（一般是引物的Tm值以下)，引物與DNA模板以堿基互補(bǔ)的方式結(jié)合，形成模板-引物雜交雙鏈。退火溫度是保證引物與DNA模板互補(bǔ)結(jié)合的關(guān)鍵。由于引物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，加之引物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于模板DNA的數(shù)量，所以DNA模板單鏈之間的互補(bǔ)結(jié)合很少。

3、延伸(elongation)

將反應(yīng)體系的溫度上升到72℃左右并維持一段時(shí)間，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物為起始點(diǎn)，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，從5'→3'方向延伸反應(yīng)，合成新的DNA雙鏈。

以上三步反應(yīng)為一個(gè)循環(huán)，重復(fù)進(jìn)行變性、退火、延伸這三步反應(yīng)，如此反復(fù)循環(huán)可以使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。上述過程1.5小時(shí)左右完成，從而使所需的目的DNA片段擴(kuò)增放大百萬倍。

二、PCR各步驟目的

1、預(yù)變性

破壞DNA中可能存在較難破壞的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使DNA充分變性，減少DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增的影響，以利于引物更好地和模板結(jié)合，特別是對(duì)于基因組來源的DNA模板，最好不要省去這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應(yīng)中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應(yīng)得以順利進(jìn)行。

2、變性一退火一延伸循環(huán)

(1)模板DNA的變性

模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙徒DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備。

(2)模板DNA與引物的退火（復(fù)性）

模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。

(3)引物的延伸

DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

3、PCR儀擴(kuò)增循環(huán)后72℃延伸10分鐘

用PCR儀擴(kuò)增時(shí)，變性一退火一延伸循環(huán)完成后，繼續(xù)72℃延伸10分鐘的原因是：

(1)在反應(yīng)體系一定的條件下，延伸時(shí)間取決于待擴(kuò)增DNA片段的長度。例如，使用Taq DNA聚合酶，72℃時(shí)的堿基摻入率為35~100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

(2)根據(jù)延伸速率推得，擴(kuò)增1kb以內(nèi)的DNA片段1分鐘即可，而3~4kb則需要3~4分鐘，依次類推。通常，在最后一輪要適當(dāng)?shù)貙⒀由鞎r(shí)間延長至4~10分鐘，這樣做是使PCR反應(yīng)wan全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量。

(3)繼續(xù)72℃延伸10分鐘除了可以使PCR反應(yīng)wan全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量外，還有一個(gè)作用是：在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。

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